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实验三：叶绿体色素提取分离与理化性质及含量测定
（一）实验目的及意义
（二）实验原理
（三）实验步骤
（四）实验报告
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实验目的和意义
因此，测定叶绿素含量便成为研究光合作用与氮代谢必不可少的手段，在作物育种、科学施肥、看叶诊断中有着广泛的应用
绿色植物的光合作用是在叶绿体中的叶绿体色素中进行的，了解叶绿体色素的组成、性质及测定对于理解光合作用的本质很有帮助。
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叶绿体在细胞中运动视频
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叶绿体在细胞中的分布与结构
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类囊体膜的结构及功能
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实验原理
植物叶绿体色素是吸收太阳光能，进行光合作用的重要物质。它一般由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
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实验原理
叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。
色素分离的方法有多种，纸层析是最简便的一种。当溶剂（有机推动剂）不断从纸上流过时，由于混合物（叶绿素提取液）中各种成分在固定相（滤纸纤维素所吸附的水分）和流动相（有机推动剂）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。
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实验原理
叶绿素中的镁可以被氢离子所取代而成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。
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实验步骤(1)
今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度D，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
Ca=12.7D663 –2.69 D645（3）
Cb=22.9 D645 –4.68D663（4）
Ck=4.7D440- 0.27Ca+b
根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度D与其中溶液浓度C和液层厚度L成正比，即：
D＝KCL
D：吸光度，即吸收光的量，C：溶液浓度, K：为比吸收系数（吸光系数）， L：液层厚度，通常为1cm.
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。
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实验材料和器材
器材：721型分光光度计、电子天平、量筒、研钵、剪刀、漏斗、滤纸、移液管（1mL）、试管及试管架、洗耳球、酒精灯等。
试剂：丙酮、80%丙酮、醋酸酮、5%盐酸、碳酸钙、石英砂等
实验材料
卤地菊叶片
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实验步骤(1)
分离：在大试管中加入推动剂，然后将滤纸固定于胶塞的小钩上，插入试管中，使尖端浸入溶剂内（色点要高于叶面，滤纸条边缘不可碰到试管壁），盖紧胶塞，直立于阴暗处层析。
当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤纸，风干，观察色带的分布。叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为**，胡萝卜素为橙**。用铅笔标出各种色素的位置和名称。
1.叶绿体色素的提取
（1）取植物新鲜叶片1克，洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放人研钵中。
（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，2-3 mL95%乙醇，研磨至糊状，再加2-3 mL95％乙醇，过滤，即得色素提取液。
2.叶绿体色素的分离
点样：取前端剪成三角形的滤纸条，用毛细管取叶绿素提取液，如图点样于“色点”处，注意每次所点溶液不可过多，点样后晾干，再重复操作数次。
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理化性质测定
2.氢和铜对叶绿素分子中镁的取代作用
方法一；取两支试管。第一支试管加叶绿体色素提取液2mL，作为对照。第二支试管加叶绿体色素提取液2 mL，再加入稀盐酸1滴，摇匀，观察溶液颜色变化。当溶液变竭后，再加入少量醋酸铜粉末，微微加热，观察记录溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。解释其颜色变化原因。
将上一个实验中提取的叶绿体色素溶液适当稀释后，进行以下实验：
1.荧光现象的观察。
取l支试管加入浓的叶绿体色素提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同，可观察到反射出暗红色的荧光。
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理化性质测定
2.氢和铜对叶绿素分子中镁的取代作用
方法一；取两支试管。第一支试管加叶绿体色素提取液2mL，作为对照。第二支试管加叶绿体色素提取液2 mL，再加入稀盐酸1滴，摇匀，观察溶液颜色变化。当溶液变竭后，再加入少量醋酸铜粉末，微微加热，观察记录溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。解释其颜色变化原因。
将上一个实验中提取的叶绿体色素溶液适当稀释后，进行以下实验：
1.荧光现象的观察。
取l支试管加入浓的叶绿体色素提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同，可观察到反射出暗红色的荧光。
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理化性质测定
4. 叶绿体色素吸收光谱曲线
将上述叶绿体色素提取液注入1cm比色杯中，另取95%乙醇作空白，于400-700nm之间，每间隔10nm读取光密度值。根据测定结果，以波长为横坐标绘制曲线，此即叶绿体色素的吸收光谱曲线。用同样的方法测定皂化作用中分离出绿色素与**素的吸收光谱曲线，并对结果进行分析。
3.皂化作用（绿色素与**素的分离）
取叶绿体色素提取液2 mL于大试管中，加入4mL乙醚，摇匀，再沿试管壁慢慢加人3～6mL蒸馏水，轻轻混匀，静置片刻，溶液即分为两层，色素已全部转入上层乙醚中。用滴管吸取上层绿色层溶液，放入另一试管中，再用蒸馏水冲洗一、二次。在色素乙醚溶液中加入30％KOH－甲醇溶液，充分摇匀，再加入蒸馏水约3 mL，摇匀静置。可以看到溶液逐渐分为两层，下层是水溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和b，上层是乙醚溶液，其中溶有**的胡萝卜素和叶黄素。将上下层放入两试管中，可供观察吸收光谱用。
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含量测定
(3）转移到25mL棕色容量瓶中，用少量80％丙酮冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入容量瓶中。最后用80％丙酮定容至25mL，摇匀。离心或过滤。
(4）将上述色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以80％丙酮为空白，在波长663nm、645nm、652nm和440nm下测定光密度。
（1）取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物，剪碎，混匀。
（2）称取剪碎的新鲜样品0.5g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3mL80％丙酮，研成匀浆，再加80％丙酮5mL，继续研磨至组织变白。
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四、实验结果计算
将测得的光密度值代入公式，分别计算叶绿素a、b、a+b和类胡萝卜素的浓度（mg／L）。
并按下式计算组织中单位鲜重或干重的各色素的含量：
色素浓度（mg／L）×提取液总体积×稀释倍数
色素在叶片中的含量（%）= ×100% 样品重量（mg）×1000
稀释倍数：若提取液未经稀释，则取1
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实验报告
1.试述叶绿体色素的吸收光谱特点及生理意义。
2.在皂化反应中加入乙醚有什么作用？
小军见到一种“化学爆竹”（见下图），只要用手拍打锡纸袋，掷在地上，锡纸袋随后就会突然爆开并伴随响声
学术研究论文写作步骤与方法
随着科学技术的发展，越来越多的学者涉及到学术论文的写作领域，那么怎样写学术论文、学术论文写作是怎样要求的、格式如何，下面就介绍一下学术论文的写作，希望能对您论文写作有所帮助。
(一)题名(Title,Topic)
...题名又称题目或标题。题名是以最恰当、最简明的词语反映论文中最重要的特定内容的逻辑组合。
论文题目是一篇论文给出的涉及论文范围与水平的第一个重要信息，也是必须考虑到有助于选定关键词不达意和编制题录、索引等二次文献可以提供检索的特定实用信息。 论文题目十分重要，必须用心斟酌选定。有人描述其重要性，用了下面的一句话：?论文题目是文章的一半?。 对论文题目的要求是：准确得体：简短精炼：外延和内涵恰如其分：醒目。
对这四方面的要求分述如下。
1.准确得体
要求论文题目能准确表达论文内容，恰当反映所研究的范围和深度。 常见毛病是：过于笼统，题不扣文。关键问题在于题目要紧扣论文内容，或论文内容民论文题目要互相匹配、紧扣，即题要扣文，文也要扣题。这是撰写论文的基本准则。
2.简短精炼
力求题目的字数要少，用词需要精选。至于多少字算是合乎要求，并无统一的?硬性?规定，一般希望一篇论文题目不要超出20个字，不过，不能由于一味追求字数少而影响题目对内容的恰当反映，在遇到两者确有矛时，宁可多用几个字也要力求表达明确。 若简短题名不足以显示论文内容或反映出属于系列研究的性质，则可利用正、副标题的方法解决，以加副标题来补充说明特定的实验材料，方法及内容等信息使标题成为既充实准确又不流于笼统和一般化。
3.外延和内涵要恰如其分
?外延?和?内涵?属于形式逻辑中的概念。所谓外延，是指一个概念所反映的每一个对象;而所谓内涵，则是指对每一个概念对象特有属性的反映。 命题时，若不考虑逻辑上有关外延和内涵的恰当运用，则有可能出现谬误，至少是不当。
4.醒目
论文题目虽然居于首先映入读者眼帘的醒目位置，但仍然存在题目是否醒目的问题，因为题目所用字句及其所表现的内容是否醒目，其产生的效果是相距甚远的。 有人对36种公开发行的医学科持期刊1987年发表的论文的部分标题，作过统计分析，从中筛选100条有错误的标题。在100条有错误的标题中，属于?省略不当?错误的占20%;属于?介词使用不当?错误的占12%)。在使用介词时产生的错误主要有：
①省略主语?第一人称代词不达意后，没有使用介词结构，使辅助成分误为主语;
②需要使用介词时又没有使用;
③不需要使
用介词结构时使用。属于?主事的错误?的占11%;属于?并列关系使用不当?错误的占9%;属于?用词不当?、?句子混乱?错误的各占9%，其它类型的错误，如标题冗长、文题不符、重复、歧意等亦时有发生。
(二)作者姓名和单位(Author and department)
这一项属于论文署名问题。署名一是为了表明文责自负，二是记录作用的劳动成果，三是便于读者与作者的联系及文献检索(作者索引)。大致分为二种情形，即：单个作者论文和多作者论文。后者按署名顺序列为第一作者、第二作者?。重要的是坚持实事求是的态度，对研究工作与论文撰写实际贡献最大的列为第一作者，贡献次之的，列为第二作者，余类推。注明作者所在单位同样是为了便于读者与作者的联系。
(三)摘要(Abstract)
论文一般应有摘要，有些为了国际交流，还有外文(多用英文)摘要。它是论文内容不加注释和评论的简短陈述。其他用是不阅读论文全文即能获得必要的信息。
摘要应包含以下内容：
①从事这一研究的目的和重要性;
②研究的主要内容，指明完成了哪些工作;
③获得的基本结论和研究成果，突出论文的新见解;
④结论或结果的意义。
论文摘要虽然要反映以上内容，但文字必须十分简炼，内容亦需充分概括，篇幅大小一般限制其字数不超过论文字数的5%。例如，对于6000字的一篇论文，其摘要一般不超出300字。
论文摘要不要列举例证，不讲研究过程，不用图表，不给化学结构式，也不要作自我评价。 撰写论文摘要的常见毛病，一是照搬论文正文中的小标题(目录)或论文结论部分的文字;二是内容不浓缩、不概括，文字篇幅过长。
(四)关键词(Key words)
关键词属于主题词中的一类。主题词除关键词外，还包含有单元词、标题词的叙词。
主题词是用来描述文献资料主题和给出检索文献资料的一种新型的情报检索语言词汇，正是由于它的出现和发展，才使得情报检索计算机化(计算机检索)成为可能。 主题词是指以概念的特性关系来区分事物，用自然语言来表达，并且具有组配功能，用以准确显示词与词之间的语义概念关系的动态性的词或词组。
关键词是标示文献关建主题内容，但未经规范处理的主题词。关键词是为了文献标引工作，从论文中选取出来，用以表示全文主要内容信息款目的单词或术语。一篇论文可选取3~8个词作为关键词。
关键词或主题词的一般选择方法是：
由作者在完成论文写作后，纵观全文，先出能表示论文主要内容的信息或词汇，这些住处或词江，可以从论文标题中去找和选，也可以从论文内容中去找和选。例如上例，关键词选用了6个，其中前三个就是从论文标题中选出的，而后三个却是从论文内容中选取出来的。后三个关键词的选取，补充了论文标题所未能表示出的主要内容信息，也提高了所涉及的概念深度。需要选出，与从标题中选出的关键词一道，组成该论文的关键词组。
关键词与主题词的运用，主要是为了适应计算机检索的需要，以及适应国际计算机联机检索的'需要。一个刊物增加?关键词?这一项，就为该刊物提高?引用率?、增加?知名度?开辟了一个新的途径。
(五)引言(Intorduction)
引言又称前言，属于整篇论文的引论部分。其写作内容包括：研究的理由、目的、背景、前人的工作和知识空白，理论依据和实验基础，预期的结果及其在相关领域里的地位、作用和意义。
引言的文字不可冗长，内容选择不必过于分散、琐碎，措词要精炼，要吸引读者读下去。引言的篇幅大小，并无硬性的统一规定，需视整篇论文篇幅的大小及论文内容的需要来确定，长的可达700~800字或1000字左右，短的可不到100字。
(六)正文(Main body)
正文是一篇论文的本论，属于论文的主体，它占据论文的最大篇幅。论文所体现的创造性成果或新的研究结果，都将在这一部分得到充分的反映。因此，要求这一部分内容充实，论据充分、可靠，论证有力，主题明确。为了满足这一系列要求，同时也为了做到层次分明、脉络清晰，常常将正文部分人成几个大的段落。这些段落即所谓逻辑段，一个逻辑段可包含几个自然段。每一逻辑段落可冠以适当标题(分标题或小标题)。
段落和划分，应视论文性质与内容而定。
一般常见的划分方式有：
①实验原材料和材料/实验方法/实验结果和分析。
②理论分析/实验装置和方法/实验结果比较与分析。
根据论文内容的需要，还可以灵活地采用其它的段落划分方案，但就一般性情况而言，大体上应包含实验部分和理论分析部分的内容。?实验结果和分析?这一部分是论文的关键部分。有人曾说：?实验的结果是论文的必脏?，这并不为过，论文的新意主要在这里体现。
不少学科的论文，还可再简化一点，例如，医学论文，常将正文部分分成两个大段落，即：?材料和方法?(或?对象和方法?)，?结果和讨论?(工?结果和分析?)。
要写好?材料和方法?这一节，应给出诸如实验所用原料或材料的技术要求、数量、来源以及制备方法等诸方面的信息，有时甚至要列出所用试剂的有关化学性质和物理性质。要避免使用商业名称，通常应使用通用化学名称。实验方法应介绍主要的实验过程，但不要机械地按通常以年、月的次序进行描述，而应该将各有关的方法结合起来描述。这样做的目的主要是使有能力的科技工作者按论文这一部分提供的信息，可以生复文中的试验及其结果，并即达到?再现性?或?可重复性?、?确证性?的要求。缺少论文写作经验与素养的人，容易将这一部分写成实验报告。
;[查阅资料]过氧化氢分解与镁和硫酸反应是两个必须掌握的化学方程式，注意不要忘记配平和漏掉条件．
（1）小军取两支试管进行实验的目的是作空白实验，进行对比，用以得到准确的结果．
（2）检验碳酸盐的方法是与酸反应，检验生成物中是否有二氧化碳．
碳酸钠和碳酸氢钠的溶解度不同，鉴别它们可以用某温度下溶解在一定量水中的多少来鉴别．
答案：[猜想与验证]
2H2O2═2H2O+O2↑ Mg+H2SO4=MgSO4+H2↑
（1）作空白实验：进行对比
（2）①稀盐酸 ②将气体通入澄清石灰水 澄清石灰水变浑浊
方法：20℃时，在100g水中加入11g该白色固体，充分溶解后，若有白色固体剩余，为碳酸氢钠；否则为碳酸钠．
[反思]碳酸盐和酸反应，在短时间内放出大量的气体，使锡纸袋爆开．
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